【研究背景】
过敏性哮chuan是一种顽固疾病，常因为炎症引发气道反应性增高，导致反复发作的chuan息、气促、胸闷或ke sou等症状，多在夜间发生，可自行或通过治疗而逆转。导致过敏性哮chuan的因素很多，除遗传因素外，哮chuan最重要的激发因素是吸入变应原，例如房尘螨，但是过敏性哮chuan是如何开始和产生的仍然是一个谜。之前研究表明2型先天性淋巴细胞（ILC2s）有助于粘膜稳态，同时会引发过敏性哮chuan。然而，ILC2s在转录上是异质性的，且对于ILC的功能状态知之甚少，指导ILC2s促进体内平衡与炎症的信号也并不清楚。随着过敏性哮*患病率逐年增加，确定ILC2s对警报素（Alarmin）反应的分子途径变得尤为重要，也是一个重要的研究领域。来自美国哈佛医学院免疫病研究中心和布莱根妇女医院的Kuchro领导的一个团队使用10X单细胞转录组测序确定了常驻在肺部中的ILC的转录谱，发现了神经系统用来与免疫细胞进行沟通的一种基本的分子线索，它可能潜在的触发过敏性肺部炎症，从而导致哮chuan。
【实验流程】
【研究结果】
1、Alarmins（警报素）诱导ILC2s的异质性
对24,187个细胞进行群体单细胞转录组测序（scRNA-seq），分析发现三种主要淋巴细胞状态：ILC1s，ILC2s，ILC3s，三种不同的ILCs聚类为11个特征亚群。警报素IL-33和IL-25差异地调控先天性淋巴细胞状态，但均激活ILC2s，高表达Il5，Klrg1和Arg1。无监督聚类分群结果显示细胞分群与警报素刺激紧密相关：亚群⑦和⑨-?中大多数细胞由IL-33激活，亚群⑤和⑧中的细胞主要由IL-25激活。被Alarmin激活的ILCs比静息ILC高1.5-2.5倍的基因表达，尤其是IL-33激活的ILC2s。
图1 通过scRNA-seq分析ILC的24,187个细胞(点)
显著差异表达的基因包含那些在ILCs生物学中具有已知作用的基因（图2f）。Arg1，Il13和Klrg1在由IL-25激活的ILC2s亚群中高度表达。例如，亚群⑤和⑧，但是Ms4a4b仅在亚群⑧中表达。经流式细胞术验证上述基因在蛋白质水平的表达，与单细胞测序结果一致。综上，各ILC亚群存在不同的基因表达和功能状态，IL-33和IL-25差异地调节这些状态。
图2 代表差异表达基因（x轴）的集群（y轴）
2、Nmur1被鉴定为ILC2特异性Marker
使用基于全长的SMART-Seq2分析了PBS，IL-25-，IL-33处理的606个ILCs细胞，其基因表达谱，聚类，以及PCA或差异表达基因与10X单细胞转录组测序的图谱高度一致；并将Nmur1鉴定为ILC2的特异性Marker（图3，上）。
图3 scRNA-seq鉴定出ILC2特异性基因
3、NMUR1在ILC2中特异性表达
NMUR1是神经肽NMU的受体，并且NMU-NMUR1信号调节炎症反应，但该途径在ILC中的作用未知。用房尘螨（HDM）提取物刺激产生气道炎症反应，Nmur1在ST2+ILC中高表达（图3,下）。通过Nmur1–LacZ报告小鼠，经流式细胞术评估NMUR1蛋白表达，大约40％的ST2+ILCs表达NMUR1（图4）。并且无论警报素如何刺激，NMUR1主要在ST2+ILC中表达，且与IL-25受体IL-17RB的表达无关。
图4 q-PCR和流式细胞术测定肺部神经肽受体NMUR1表达量
4、神经肽NMU显著扩大IL-25驱动的过敏性炎症
通过qPCR评估，在体外，NMU仅轻度上调Il5和Il13，但是当与IL-25联合时，NMU显著增加了Il5和Il13的mRNA和蛋白质表达，L-33和NMU的组合也增加IL-5和IL-13的表达，但程度低于IL-25与NMU结合。在体内，IL-25和NMU之间的协同作用更为显着，IL-25与NMU联合引起显着的气道反应（图5）。其不增加肺组织中IL5或IL13的 mRNA的表达，而强烈地增加肺和BALF嗜酸粒细胞增多，并显着增强组织病理学炎症。总之，神经肽NMU将非病理剂量的IL-25转化为病理剂量。为研究内源性神经肽NMU在ILCs中的作用，分析NMU缺陷型（Nmu-knockout）与野生型（WT）小鼠中的ILCs：过敏原攻击Nmu-knockout小鼠后表达效应细胞因子的ILC2s频率降低，表明NMU显著促进ILC激活和效应功能—炎症反应。
图5 NMU促进IL-25诱导的过敏性炎症
5、IL-25+NMU结合加重炎性ILC2s表达
Burkett说，“ke sou是由神经系统调节和控制的，我们的发现表明了NMU的作用：它能够诱导平滑肌收缩和炎症。”用PBS，NMU，IL-25和IL-25+NMU四种警报素激活ILCs，PBS（9,623个细胞），NMU（9,698个细胞），IL-25（6,849个细胞）和NMU+IL-25（9,372个细胞），单细胞转录组测序分析35,542个肺部驻留的ILC ，非监督聚类将它们分成11个簇（图6）。其中五个簇几乎完全由IL-25或IL-25+NMU活化的细胞组成。IL-25+NMU协同作用的一个机制是通过诱导不同亚群ILCs的增殖；用IL-25+NMU刺激的ILC比IL-25刺激的ILC的Ki67+ILC增加约两倍，表明有显着的增殖。IL-25+NMU协同作用的另一个机制是通过上调ILCs中IL-17RB表达；经流式细胞术评估IL-25+NMU 比单独的IL-25显著提高IL-17R+ILC 的频率，并通过定量实时PCR验证发现其上调肺中Il17rb的表达。
图6 IL-25和NMU协同活化炎性ILC2s
6、HDM促进神经肽受体NMUR1激活ILC2
表征NMUR1信号传导对ILCs产生的影响，用HDM刺激野生型（WT）和Nmur1敲除(Nmur1-KO)小鼠，单细胞转录组测序分析21,895个单细胞，表征了ILC2s在WT和Nmur1-KO小鼠中的表达量（图7）。在Nmur1-KO小鼠中，与PBS对照相比，HDM刺激后ILC2频率显着降低，在WT小鼠中也出现的这种趋势，这与HDM刺激后Nmur1-KO小鼠中ST2+ILCs的降低频率一致。基于用HDM和PBS处理的野生型ILC2s之间差异表达的基因，研究定义了炎性ILC2标签（图7c）。IL-25+NMU刺激的ILCs高度表征了这种炎症信号，表明它识别与气道炎症模型无关的炎症ILC2s（图7d）。来自HDM处理的小鼠的ILC2s中的差异表达基因与用IL-25+NMU组合的小鼠的ILC2s中的那些显着重叠。在HDM攻击后，Nmur1-KO小鼠的ILC2s的平均炎性低于WT小鼠（图7e）。
图7 NMUR1信号调节过敏原攻击后的ILC应答
综合起来，研究结果表征了一种新的导致免疫炎症的神经-免疫通路，其加剧了体内粘膜过敏性炎症。这些发现将为如何预防或治疗过敏性哮*提供新的治疗见解，可能导致人们开发出治疗哮*的新疗法。
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