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近岸类器官课堂-您护肝,我养肝

作者:苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 2023-05-24T10:19 (访问量:5223)

肝脏是人体中最大的器官之一,是调节营养吸收和代谢的主要器官,能够中和摄入的有毒化合物,并产生体内近50%的循环蛋白质。肝脏由多种细胞类型组成,其中占比最高的是功能多样的肝细胞。

 

肝脏作为重要的“解毒”器官,在执行日常功能时会受到各种代谢、病毒的侵害,可能会导致不同程度的肝损伤。长期损伤形成的纤维化疤痕破坏了肝脏的完整性,并且还会诱导门静脉高血压等其它疾病。在大多数肝脏疾病和药物诱导的肝损伤(DILI)中,损伤始于肝细胞,同时也会激活其它类型细胞(如:KC和HSC)。因此,为了充分理解每种肝病的表型和损伤器官的机制,我们需要建立复杂的体外肝模型,以便于更好地进行肝脏相关的疾病和毒性研究。

 

本篇文章基于Nature protocols【1】Journal of hepatology【2】发表的两篇文章,整理了人类诱导多能干细胞(human iPSCs)来源的肝脏类器官培养方案。
 

 

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图1. 人iPSCs来源的肝类器官培养方案【2】

 

细胞来源

Human iPSCs

 

培养基配方

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iPSCs培养和传代

 

1.将100mm培养皿包被5ml 0.1%(w/v)的明胶,室温静置15min至明胶凝固。

2.在明胶上接种丝裂霉素处理过的MEFs细胞悬浮液,细胞数约为1.8×106个。放置在37℃,5%CO2的培养箱中培养至细胞汇合度70-80%时进行传代。

3.吸去MEFs培养基,将iPSCs接种于明胶上,添加10ml iPSCs(I)培养基,放置在37℃,5%CO2的培养箱中培养3-5天。
 

定向内胚层分化

 

4. 在60mm培养皿中加入2ml Matrigel,室温静置2h并添加DMEM-F12培养基至完全没过Matrigel。

5. 用不含Ca2+/Mg2+的PBS冲洗iPSCs后,加入300μl Accutase,37℃孵育3-4min。

6. 将消化下来的细胞悬液收集并90g离心5min,收集细胞沉淀并加入iPSCs(II)培养基,同时进行细胞计数。

7. 将iPSCs接种在Matrigel平板上,接种密度为1.5×106个/60mm平皿,接种后添加4ml iPSCs(II)培养基,放置在37℃,5%CO2的培养箱中过夜培养。

8. 接种后第二天,用DEs培养基进行换液,放置在37℃,5%CO2的培养箱中培养6天,每2天换液一次。
 

肝内胚层分化

 

9. 用HEs培养基进行换液,放置在37℃,5%低氧的培养箱中培养3天。

10. 用HEs(II)培养基进行换液,放置在37℃,5%低氧的培养箱中培养4天,之后转移至常氧条件下培养8天,达到肝成熟。
 

类器官培养

 

11. 肝成熟后的9-12天,在单层肝细胞上会出现三维结构,此时将漂浮的囊泡状细胞收集起来,加入Matrigel并放置在37℃条件下10min使Matrigel凝固。

12. 添加HM培养基并完全没过Matrigel顶部,每3天更换培养基,每7天机械传代一次类器官。


类器官扩增和分化

 

13. 将HM培养基吸出,用PBS清洗后,加入EM培养基,放置在37℃,5%低氧的培养箱中培养4天进行类器官扩增。

14. 随后用DM培养基进行换液,放置在37℃,5%CO2的培养箱中培养6天,完成进一步分化。
 

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图2. 扩增培养基(EM)和分化培养基(DM)孵育后的肝类器官免疫荧光图【2】

 

肝类器官应用前景
 

类器官是一种能够进行体外更新和自组装的模型,相比于传统的二维(2D)细胞培养,类器官的生长环境更贴合生理条件。3D培养的肝类器官可以用于疾病建模,以便确定疾病的机制以及治疗方法。研究表明,3D培养的iPSC来源的肝类器官比2D干细胞更易感染乙型肝炎病毒【3】。2019年Ouchi, R.et al.【4】利用iPSCs来源的肝类器官,在体外模拟了炎症和纤维化,为进一步了解Wolman疾病打下了基础。

 

在药物毒性验证方面,肝类器官同样发挥着重要的作用。对乙酰氨基酚是药物引起肝衰竭的最常见来源,利用肝脏类器官可以实现药物的肝毒性验证,更适用于未来的药物筛选和开发【5】

 

类器官作为一种研究模型,在发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等方面潜力巨大。但是,类器官培养技术建立过程中会面临多种挑战。为了更轻松更高效的建立类器官培养技术,欢迎各位扫码加入类器官培养交流群,在这里会有专业的技术支持人员帮您解惑答疑,也将定期分享类器官前沿进展,让类器官培养更简单!

 

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类器官培养交流群

   

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Human NRG1-beta 1

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Human R-spondin 3 (C-Fc-6His)

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C089

Human Shh (C24II)

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CH66

Mouse Shh(C25II)

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C18K

Human Wnt3a V2

 

  

参考文献

【1】TAKEBE, Takanori, et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature protocols, 2014, 9.2: 396-409.

 

【2】MUN, Seon Ju, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of hepatology, 2019, 71.5: 970-985.

 

【3】Nie, Y. Z. et al.(2018). Recapitulation of hepatitis B virus–host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine, 35, 114-123.

 

【4】Ouchi, R. et al. (2019). Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell metabolism, 30(2), 374-384.

 

【5】Sgodda, M. et al. (2017). A scalable approach for the generation of human pluripotent stem cell-derived hepatic organoids with sensitive hepatotoxicity features. Stem cells and development, 26(20), 1490-1504.






 

 
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